背景知識(shí)：

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修飾途徑之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鳥嘌呤（7-mG）。結(jié)構(gòu)基因含有很多CpG結(jié)構(gòu)，2CpG和2GpC中兩個(gè)胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且兩個(gè)甲基集團(tuán)在DNA雙鏈大溝中呈特定三維結(jié)構(gòu)?；蚪M中60%～ 90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地組成CpG島，位于結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。DNA的甲基化修飾是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要手段。

主要檢測(cè)方法及原理:

亞硫酸氫鈉測(cè)序法   Bisulfite Genomic Sequencing PCR，BSP

亞硫酸氫鈉測(cè)序法是建立在MSP基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入研究CpG島各個(gè)位點(diǎn)甲基化情況的方法。重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴(kuò)增（引物設(shè)計(jì)時(shí)盡量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響）所需片段，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。最后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化。

BSP檢測(cè)流程圖

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：此方法一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。在尋找有意義的關(guān)鍵性CpG位點(diǎn)上，有其他方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。限制性：每次至多能夠檢測(cè)450 bp內(nèi)的基因甲基化狀態(tài)。

甲基化特異性的PCR     Methylation Specific PCR，MSP

甲基化特異性是一種特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。因此從理論上講，用不同的引物做PCR，即可檢測(cè)出這種差異，從而確定基因有無CpG島甲基化。

MSP檢測(cè)流程圖

MSP檢測(cè)結(jié)果

    技術(shù)優(yōu)勢(shì)：這是檢測(cè)基因甲基化的經(jīng)典方法，是一種簡便的、特異的、敏感的檢測(cè)單基因甲基化的方法。可以用于高通量樣品基因特異位點(diǎn)甲基化的檢測(cè)。限制性：因采用甲基化特異性引物進(jìn)行PCR，該方法一次只能檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)。

樣品準(zhǔn)備條件：

細(xì)胞樣品：收集細(xì)胞后放入液氮中速凍保存或速凍24 h后轉(zhuǎn)入-80 °C冰箱保存。

組織樣品：動(dòng)物組織一般取材后立即放入液氮中速凍保存，液氮凍存24 h后可轉(zhuǎn)入-80 °C冰箱保存。特殊組織（植物等）建議直接進(jìn)行甲基化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

所有樣品的處理和保存過程中，切忌反復(fù)凍融。

   樣品運(yùn)輸條件：樣品運(yùn)輸條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品的處理?xiàng)l件，可以選擇液氮或者干冰運(yùn)輸。

您只需提供：

新鮮且足量的樣品（組織不少于50 mg，細(xì)胞不少于10⁷，全血不少于500 μl），或純化好的符合實(shí)驗(yàn)要求的DNA（≥ 5 μg/樣），檢測(cè)的基因信息，相關(guān)文獻(xiàn)等。

我們提供：

實(shí)驗(yàn)報(bào)告單，MSP電泳圖/BSP測(cè)序圖等。